A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较
作者：邓瑞春 张明伟 白云秀 汪劲松 黄 英 毛 宁p|@r&, 百拇医药
单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850p|@r&, 百拇医药
关键词：A蛋白；亲和层析柱；抗体p|@r&, 百拇医药
免疫学杂志990218 摘 要 比较Hitrap Protein-A Sepharose亲和层析系统，对不同动物血清或抗血清的纯化效率，提供抗体纯化提供依据。结果显示该方法简便快速，纯化的抗体纯度高，并能较好地保持免疫学活性。层析柱反复使用40多次，纯化效率不变。但Protein-A对不同动物血清的IgG吸附能力不同。提示，应根据动物品种，选择合适的纯化方法。p|@r&, 百拇医药
中图号 R371-33p|@r&, 百拇医药
COMPARISON OF IgG PURIFICATION FROMp|@r&, 百拇医药
DIFFERENT ANIMAL SERA BY HITRAP PROTEINp|@r&, 百拇医药
A AFFINITY CHROMATO-GRAPHYp|@r&, 百拇医药
Deng Ruichun，Zhang Mingwei，Mao Ningp|@r&, 百拇医药
(Beijing Read ＆ Four-Ring Institute of Biotechnology，Beijing 100850)p|@r&, 百拇医药
Abstract Several kinds of IgG from different animal sera or antisera were purified by Hitrap protein A affinity chromatography，and their purities were compared.The results show that Hitrap protein A affinity chromatography might be an easy and efficient way to purify IgG.The Hitrap gel still works well in adsorbing the IgG after a long time use.But there are some difference among the ability of absorption of IgG from different sera.
Key words Protein A，Affinity chromatography，Antibodyk3z0g, 百拇医药
抗体现已广泛应用于生命科学的许多领域，尤其在疾病的诊断治疗和基础研究中发挥了越来越重要的作用。因为含有抗体的血清中有许多杂蛋白等，一般都需要先将抗体分离纯化。本文在比较了辛酸法和离子交换凝胶过滤法的基础上，进一步对Protein-A Sepharose affinity Chromatography进行了比较研究，现将结果报告如下。k3z0g, 百拇医药
1 材料和方法k3z0g, 百拇医药
1.1 材料k3z0g, 百拇医药
正常鼠血清、正常豚鼠血清、正常人血清、羊抗鼠血清、驴抗兔血清、兔抗大肠杆菌DH5α血清均由本室自制；Hitrap Protein-A Sepharose affinity columns(Pharmacia瑞典)；过氧化物酶(简称HRP，RZ＝3 sigma USA)。k3z0g, 百拇医药
紫外分光光度计(BECKMAN DU-600)；电泳仪和电泳槽(北京六一仪器厂)；酶联免疫测定仪(BDSL Immunoskman 340型)；超滤器(MICON8010)；激光扫描仪(Pharmacia LKB Ultrosan)k3z0g, 百拇医药
1.2 方法k3z0g, 百拇医药
1.2.1 抗体纯化：将1ml的HiTrap Protein-A Sepharose affinity column固定在铁架台上。用至少6倍体积的去离子水或起始缓冲液，洗出保护剂溶液。然后用2倍柱床体积的起始缓冲液平衡柱子，测定洗出液与起始缓冲液pH相同时，用注射器将血清样品注入，同时收集流出液。用至少8倍体积的0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，收集洗脱液。用至少6倍体积的0.1mol/L，pH3.0柠檬酸缓冲液洗脱吸附于柱上的IgG，同时收集样品。测定280nm和260nm吸光度。k3z0g, 百拇医药
1.2.2 抗体纯度鉴定[1]k3z0g, 百拇医药
1.2.3 蛋白浓度测定[2]：根据下列公式计算蛋白含量：mg/ml＝1.45×OD280nm-0.74×OD260nmk3z0g, 百拇医药
1.2.4 纯化样品的浓缩采用超滤法。fj/z, 百拇医药
1.2.5 HRP标记IgG[3]fj/z, 百拇医药
1.2.6 双抗体夹心ELISA法[4]fj/z, 百拇医药
2 结果和讨论fj/z, 百拇医药
2.1 纯度测定 按本文所报告的实验条件，分别收集PB洗脱部分和柠檬酸缓冲液洗脱部分。所得样品进行PAGE电泳，测定IgG纯度及抗体的回收量。结果见图1。
fj/z, 百拇医药
图 1 纯化各步洗脱样品PAGE图fj/z, 百拇医药
Fig 1 PAGEfj/z, 百拇医药
①～⑥PB buffer elution fraction from goat anti-mouse serum，mouse serum，donkey anti-rabbit serum，human serum，guineapig serum，rabbit anti-DH5 α serum respectivily；(1)～(6)citric acid buffer elution fraction from goat anti-mouse serum，mouse serum，donkey anti-rabbit serum，human serum，guineapig serum，rabbit anti-DH5 α serum respectivilyfj/z, 百拇医药
图2为HiTrap Protein-A Sepharose affinity column纯化兔抗大肠杆菌DH5α的柠檬酸缓冲液洗脱部分，经PAGE电泳后的激光扫描结果。
fj/z, 百拇医药
图 2 豚鼠血清的柠檬酸缓冲液洗脱部分的激光扫描结果fj/z, 百拇医药
Fig 2 Effect of laser scanning PAGE citric acid buffer elution fraction of guineapig serum
表1列出了其它几种动物纯化效果。*9y295, http://www.100md.com
表1 各步洗脱样品IgG的含量比*9y295, http://www.100md.com
Tab 1 Ratios of IgG content of pB and citric acid elution fraction*9y295, http://www.100md.com
Serum*9y295, http://www.100md.com
PB buffer*9y295, http://www.100md.com
Citric acid buffer*9y295, http://www.100md.com
IgG(%)*9y295, http://www.100md.com
Guineapig serum*9y295, http://www.100md.com
14.32*9y295, http://www.100md.com
100*9y295, http://www.100md.com
Human serum*9y295, http://www.100md.com
25.06*9y295, http://www.100md.com
100*9y295, http://www.100md.com
Donkey anti-rabbit serum*9y295, http://www.100md.com
36.87*9y295, http://www.100md.com
100*9y295, http://www.100md.com
Rabbit anti-DH5α serum*9y295, http://www.100md.com
7.55*9y295, http://www.100md.com
96.92*9y295, http://www.100md.com
Mouse serum*9y295, http://www.100md.com
30.74*9y295, http://www.100md.com
94*9y295, http://www.100md.com
Goat anti-mouse serum*9y295, http://www.100md.com
42.49*9y295, http://www.100md.com
88*9y295, http://www.100md.com
从图1和表1可见：首先，PB洗脱部分，羊、小鼠、驴、人血清中仍有大部分IgG没能被回收，而豚鼠、兔的IgG含量却很少。说明，Protein-A对前几种动物的IgG吸附能力弱，使得部分IgG随PB洗脱掉，降低了IgG的回收率；而对后两种动物IgG回收效果较好。其次，从柠檬酸缓冲液洗脱部分，豚鼠、人、驴的IgG纯度均达到一条带，即含量均100%，小鼠、羊除γ球蛋白带以外，在白蛋白部位还有较浅的蛋白带。
图2例举的是用Protein-Asepharose affinity column纯化豚鼠血清的激光扫描结果，可见IgG纯度为100%。45hsm, 百拇医药
上述结果显示，Protein-A对动物血清IgG具有特异吸附能力，而对血清其它成分吸附能力很弱。这种特性可能与Protein-A的结构有关，即：Protein-A有6个不同的区域，其中5个与IgG的Fc区有强的结合能力，所以它能特异吸附IgG。但是，Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同。这一结果可能因为不同动物IgG的Fc区结构不同，从而造成Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同的现象。45hsm, 百拇医药
2.2 IgG的回收 表2为Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量。从表2可见，正常人、豚鼠、兔抗DH5α血清IgG的回收量都较高，而羊抗鼠、正常小鼠、驴抗兔的血清IgG回收量则较低，这一结果与上述电泳结果一致。此结果与文献报道的结果也基本一致。只是小鼠的结果略有不同，即Hitrap affincity culunm说明书为不吸附，本实验结果则为弱吸附。用此亲和层析系统还对驴血清进行了纯化，结果显示，Protein-A对驴的IgG有中等强度的吸附。此结果，尚未见文献报道。 表2 Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量45hsm, 百拇医药
Tab 2 Recovery amount of IgG45hsm, 百拇医药
Serum45hsm, 百拇医药
Amount45hsm, 百拇医药
(ml)45hsm, 百拇医药
Times45hsm, 百拇医药
Mean recovery amount45hsm, 百拇医药
of IgG(mg/ml)45hsm, 百拇医药
Guineapig serum45hsm, 百拇医药
145hsm, 百拇医药
445hsm, 百拇医药
7.4445hsm, 百拇医药
Human serum
1]lf2$, 百拇医药
4]lf2$, 百拇医药
9.40]lf2$, 百拇医药
Donkey anti-rabbit serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
4]lf2$, 百拇医药
5.0]lf2$, 百拇医药
Rabbit anti-DH5α serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
16]lf2$, 百拇医药
8.97]lf2$, 百拇医药
Mouse serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
5]lf2$, 百拇医药
3.74]lf2$, 百拇医药
Goat anti-mouse serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
5]lf2$, 百拇医药
2.47]lf2$, 百拇医药
此外，IgG回收量与层析过程中上样量有关，通过对兔抗DH5α血清上样量进行比较，用1ml Hitrap Protein A Sepharose亲和层析柱，上样量以1ml为宜。当上样量大于2ml时，IgG回收量与1ml上样时相差不大，这说明上样量过大时，可能超过了Protein-A对IgG的吸附限度，因而造成IgG的浪费。]lf2$, 百拇医药
2.3 Protein-A Sepharose使用次数测试及效果观察 我们使用1ml Protein-A Sepharose层析系统对各种不同动物血清共进行43次(44.5ml)的抗体纯化，抗体的纯化效率未见改变。以兔抗DH5α为例，在第3～13次时，抗体的平均回收率为每毫升血清9.0mg，到了第37～38次时，抗体的回收率为每毫升9.5ml。前后几次，抗体的纯度均达到电泳一条带的纯度。说明，该层析柱具有较好的稳定性，能耐受强酸的反复处理。这一特点，可以大大提高层析柱的使用效率，降低使用成本。
2.4 与辛酸法和离子交换凝胶过滤法比较 以前，我们曾报导过用辛酸法和离子交换凝胶过滤法纯化抗体的效果比较，现将3种方法纯化抗血清的某些特点总结于表3。从表3可见，亲和层析法纯化的抗体纯度高、时间短效率高、再生方法简单、抗体免疫活性好。所以是一种很有实用价值的纯化方法。 表3 3种纯化抗体方法比较.@t@cr, 百拇医药
Tab 3 Comparison of three methods for purification of antibody.@t@cr, 百拇医药
Methods.@t@cr, 百拇医药
Purity.@t@cr, 百拇医药
Time.@t@cr, 百拇医药
Quantity.@t@cr, 百拇医药
Regenration of gel.@t@cr, 百拇医药
Caprylic acid method.@t@cr, 百拇医药
>95%.@t@cr, 百拇医药
>12h.@t@cr, 百拇医药
A large.@t@cr, 百拇医药
No.@t@cr, 百拇医药
Ion-exchange sephadex chromatography.@t@cr, 百拇医药
<90%.@t@cr, 百拇医药
>96h.@t@cr, 百拇医药
A small-medium.@t@cr, 百拇医药
Complex.@t@cr, 百拇医药
Protein A affinity chromatography.@t@cr, 百拇医药
100%.@t@cr, 百拇医药
<5min.@t@cr, 百拇医药
A small-medium.@t@cr, 百拇医药
Simple
2.5 纯化抗体的初步应用 兔抗DH5α酶标抗体的应用：采用文献[3]的改良过碘酸钠氧化法，对上面纯化的兔抗DH5α抗体标记辣根过氧化物酶。4mgHRP与6mg兔抗DH5α结合，得2ml，共4.194mg的HRP-IgG。当包被兔抗DH52 IgG浓度为4μg/ml、DH52菌体蛋白浓度0.625ng/ml时，将此酶标抗体稀释4 000倍，测得A492nm为1.148。此结果进一步说明，用Protein-A Sepharose亲和层析柱纯化的抗体纯度高，并很好地保持了IgG的免疫活性，符合制备HRP标记抗体的标准。;&ctk1, 百拇医药
2.6 结论 Hitrap Protein-A Sepharose柱纯化抗体，纯度高、效率好。反复使用数十次，抗体纯度和活性不受影响。该层析系统对不同动物血清IgG有不同的吸附能力。这方面的数据应进一步积累，以便为抗体纯化工作提供选择依据。我们对该方法的实验条件进行了摸索，首先，各阶段洗脱体积都应适当加大，比如，按说明书上方法，要求使用5个柱床体积PB洗脱杂蛋白，但我们用此体积时，A280仍大于0.1，并未将杂蛋白完全洗净，所以我们使用的是8个柱床体积PB来洗脱杂蛋白。对上样量测试结果显示，1ml Hitrap Protein A Sepharose每次上样1ml较为适宜，超过2ml可造成IgG的损失。;&ctk1, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，37岁，硕士，助理研究员;&ctk1, 百拇医药
参考文献;&ctk1, 百拇医药
1 萨母布鲁J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指导.金冬雁，黎孟枫，等译.北京：科学出版社，1992;&ctk1, 百拇医药
2 方福德，周 吕，丁 濂，等.现代医学实验技巧全书(下册).北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995;&ctk1, 百拇医药
3 李成文.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992;&ctk1, 百拇医药
4 汪濂主.现代医学实验方法.北京：科学出版社，1997;&ctk1, 百拇医药
(1998-06-15收稿；1998-12-29修回)(邓瑞春 张明伟 白云秀 汪劲松 黄 英 毛 宁)
单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850p|@r&, 百拇医药
关键词：A蛋白；亲和层析柱；抗体p|@r&, 百拇医药
免疫学杂志990218 摘 要 比较Hitrap Protein-A Sepharose亲和层析系统，对不同动物血清或抗血清的纯化效率，提供抗体纯化提供依据。结果显示该方法简便快速，纯化的抗体纯度高，并能较好地保持免疫学活性。层析柱反复使用40多次，纯化效率不变。但Protein-A对不同动物血清的IgG吸附能力不同。提示，应根据动物品种，选择合适的纯化方法。p|@r&, 百拇医药
中图号 R371-33p|@r&, 百拇医药
COMPARISON OF IgG PURIFICATION FROMp|@r&, 百拇医药
DIFFERENT ANIMAL SERA BY HITRAP PROTEINp|@r&, 百拇医药
A AFFINITY CHROMATO-GRAPHYp|@r&, 百拇医药
Deng Ruichun，Zhang Mingwei，Mao Ningp|@r&, 百拇医药
(Beijing Read ＆ Four-Ring Institute of Biotechnology，Beijing 100850)p|@r&, 百拇医药
Abstract Several kinds of IgG from different animal sera or antisera were purified by Hitrap protein A affinity chromatography，and their purities were compared.The results show that Hitrap protein A affinity chromatography might be an easy and efficient way to purify IgG.The Hitrap gel still works well in adsorbing the IgG after a long time use.But there are some difference among the ability of absorption of IgG from different sera.
Key words Protein A，Affinity chromatography，Antibodyk3z0g, 百拇医药
抗体现已广泛应用于生命科学的许多领域，尤其在疾病的诊断治疗和基础研究中发挥了越来越重要的作用。因为含有抗体的血清中有许多杂蛋白等，一般都需要先将抗体分离纯化。本文在比较了辛酸法和离子交换凝胶过滤法的基础上，进一步对Protein-A Sepharose affinity Chromatography进行了比较研究，现将结果报告如下。k3z0g, 百拇医药
1 材料和方法k3z0g, 百拇医药
1.1 材料k3z0g, 百拇医药
正常鼠血清、正常豚鼠血清、正常人血清、羊抗鼠血清、驴抗兔血清、兔抗大肠杆菌DH5α血清均由本室自制；Hitrap Protein-A Sepharose affinity columns(Pharmacia瑞典)；过氧化物酶(简称HRP，RZ＝3 sigma USA)。k3z0g, 百拇医药
紫外分光光度计(BECKMAN DU-600)；电泳仪和电泳槽(北京六一仪器厂)；酶联免疫测定仪(BDSL Immunoskman 340型)；超滤器(MICON8010)；激光扫描仪(Pharmacia LKB Ultrosan)k3z0g, 百拇医药
1.2 方法k3z0g, 百拇医药
1.2.1 抗体纯化：将1ml的HiTrap Protein-A Sepharose affinity column固定在铁架台上。用至少6倍体积的去离子水或起始缓冲液，洗出保护剂溶液。然后用2倍柱床体积的起始缓冲液平衡柱子，测定洗出液与起始缓冲液pH相同时，用注射器将血清样品注入，同时收集流出液。用至少8倍体积的0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，收集洗脱液。用至少6倍体积的0.1mol/L，pH3.0柠檬酸缓冲液洗脱吸附于柱上的IgG，同时收集样品。测定280nm和260nm吸光度。k3z0g, 百拇医药
1.2.2 抗体纯度鉴定[1]k3z0g, 百拇医药
1.2.3 蛋白浓度测定[2]：根据下列公式计算蛋白含量：mg/ml＝1.45×OD280nm-0.74×OD260nmk3z0g, 百拇医药
1.2.4 纯化样品的浓缩采用超滤法。fj/z, 百拇医药
1.2.5 HRP标记IgG[3]fj/z, 百拇医药
1.2.6 双抗体夹心ELISA法[4]fj/z, 百拇医药
2 结果和讨论fj/z, 百拇医药
2.1 纯度测定 按本文所报告的实验条件，分别收集PB洗脱部分和柠檬酸缓冲液洗脱部分。所得样品进行PAGE电泳，测定IgG纯度及抗体的回收量。结果见图1。
fj/z, 百拇医药图 1 纯化各步洗脱样品PAGE图fj/z, 百拇医药
Fig 1 PAGEfj/z, 百拇医药
①～⑥PB buffer elution fraction from goat anti-mouse serum，mouse serum，donkey anti-rabbit serum，human serum，guineapig serum，rabbit anti-DH5 α serum respectivily；(1)～(6)citric acid buffer elution fraction from goat anti-mouse serum，mouse serum，donkey anti-rabbit serum，human serum，guineapig serum，rabbit anti-DH5 α serum respectivilyfj/z, 百拇医药
图2为HiTrap Protein-A Sepharose affinity column纯化兔抗大肠杆菌DH5α的柠檬酸缓冲液洗脱部分，经PAGE电泳后的激光扫描结果。
fj/z, 百拇医药图 2 豚鼠血清的柠檬酸缓冲液洗脱部分的激光扫描结果fj/z, 百拇医药
Fig 2 Effect of laser scanning PAGE citric acid buffer elution fraction of guineapig serum
表1列出了其它几种动物纯化效果。*9y295, http://www.100md.com
表1 各步洗脱样品IgG的含量比*9y295, http://www.100md.com
Tab 1 Ratios of IgG content of pB and citric acid elution fraction*9y295, http://www.100md.com
Serum*9y295, http://www.100md.com
PB buffer*9y295, http://www.100md.com
Citric acid buffer*9y295, http://www.100md.com
IgG(%)*9y295, http://www.100md.com
Guineapig serum*9y295, http://www.100md.com
14.32*9y295, http://www.100md.com
100*9y295, http://www.100md.com
Human serum*9y295, http://www.100md.com
25.06*9y295, http://www.100md.com
100*9y295, http://www.100md.com
Donkey anti-rabbit serum*9y295, http://www.100md.com
36.87*9y295, http://www.100md.com
100*9y295, http://www.100md.com
Rabbit anti-DH5α serum*9y295, http://www.100md.com
7.55*9y295, http://www.100md.com
96.92*9y295, http://www.100md.com
Mouse serum*9y295, http://www.100md.com
30.74*9y295, http://www.100md.com
94*9y295, http://www.100md.com
Goat anti-mouse serum*9y295, http://www.100md.com
42.49*9y295, http://www.100md.com
88*9y295, http://www.100md.com
从图1和表1可见：首先，PB洗脱部分，羊、小鼠、驴、人血清中仍有大部分IgG没能被回收，而豚鼠、兔的IgG含量却很少。说明，Protein-A对前几种动物的IgG吸附能力弱，使得部分IgG随PB洗脱掉，降低了IgG的回收率；而对后两种动物IgG回收效果较好。其次，从柠檬酸缓冲液洗脱部分，豚鼠、人、驴的IgG纯度均达到一条带，即含量均100%，小鼠、羊除γ球蛋白带以外，在白蛋白部位还有较浅的蛋白带。
图2例举的是用Protein-Asepharose affinity column纯化豚鼠血清的激光扫描结果，可见IgG纯度为100%。45hsm, 百拇医药
上述结果显示，Protein-A对动物血清IgG具有特异吸附能力，而对血清其它成分吸附能力很弱。这种特性可能与Protein-A的结构有关，即：Protein-A有6个不同的区域，其中5个与IgG的Fc区有强的结合能力，所以它能特异吸附IgG。但是，Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同。这一结果可能因为不同动物IgG的Fc区结构不同，从而造成Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同的现象。45hsm, 百拇医药
2.2 IgG的回收 表2为Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量。从表2可见，正常人、豚鼠、兔抗DH5α血清IgG的回收量都较高，而羊抗鼠、正常小鼠、驴抗兔的血清IgG回收量则较低，这一结果与上述电泳结果一致。此结果与文献报道的结果也基本一致。只是小鼠的结果略有不同，即Hitrap affincity culunm说明书为不吸附，本实验结果则为弱吸附。用此亲和层析系统还对驴血清进行了纯化，结果显示，Protein-A对驴的IgG有中等强度的吸附。此结果，尚未见文献报道。 表2 Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量45hsm, 百拇医药
Tab 2 Recovery amount of IgG45hsm, 百拇医药
Serum45hsm, 百拇医药
Amount45hsm, 百拇医药
(ml)45hsm, 百拇医药
Times45hsm, 百拇医药
Mean recovery amount45hsm, 百拇医药
of IgG(mg/ml)45hsm, 百拇医药
Guineapig serum45hsm, 百拇医药
145hsm, 百拇医药
445hsm, 百拇医药
7.4445hsm, 百拇医药
Human serum
1]lf2$, 百拇医药
4]lf2$, 百拇医药
9.40]lf2$, 百拇医药
Donkey anti-rabbit serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
4]lf2$, 百拇医药
5.0]lf2$, 百拇医药
Rabbit anti-DH5α serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
16]lf2$, 百拇医药
8.97]lf2$, 百拇医药
Mouse serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
5]lf2$, 百拇医药
3.74]lf2$, 百拇医药
Goat anti-mouse serum]lf2$, 百拇医药
1]lf2$, 百拇医药
5]lf2$, 百拇医药
2.47]lf2$, 百拇医药
此外，IgG回收量与层析过程中上样量有关，通过对兔抗DH5α血清上样量进行比较，用1ml Hitrap Protein A Sepharose亲和层析柱，上样量以1ml为宜。当上样量大于2ml时，IgG回收量与1ml上样时相差不大，这说明上样量过大时，可能超过了Protein-A对IgG的吸附限度，因而造成IgG的浪费。]lf2$, 百拇医药
2.3 Protein-A Sepharose使用次数测试及效果观察 我们使用1ml Protein-A Sepharose层析系统对各种不同动物血清共进行43次(44.5ml)的抗体纯化，抗体的纯化效率未见改变。以兔抗DH5α为例，在第3～13次时，抗体的平均回收率为每毫升血清9.0mg，到了第37～38次时，抗体的回收率为每毫升9.5ml。前后几次，抗体的纯度均达到电泳一条带的纯度。说明，该层析柱具有较好的稳定性，能耐受强酸的反复处理。这一特点，可以大大提高层析柱的使用效率，降低使用成本。
2.4 与辛酸法和离子交换凝胶过滤法比较 以前，我们曾报导过用辛酸法和离子交换凝胶过滤法纯化抗体的效果比较，现将3种方法纯化抗血清的某些特点总结于表3。从表3可见，亲和层析法纯化的抗体纯度高、时间短效率高、再生方法简单、抗体免疫活性好。所以是一种很有实用价值的纯化方法。 表3 3种纯化抗体方法比较.@t@cr, 百拇医药
Tab 3 Comparison of three methods for purification of antibody.@t@cr, 百拇医药
Methods.@t@cr, 百拇医药
Purity.@t@cr, 百拇医药
Time.@t@cr, 百拇医药
Quantity.@t@cr, 百拇医药
Regenration of gel.@t@cr, 百拇医药
Caprylic acid method.@t@cr, 百拇医药
>95%.@t@cr, 百拇医药
>12h.@t@cr, 百拇医药
A large.@t@cr, 百拇医药
No.@t@cr, 百拇医药
Ion-exchange sephadex chromatography.@t@cr, 百拇医药
<90%.@t@cr, 百拇医药
>96h.@t@cr, 百拇医药
A small-medium.@t@cr, 百拇医药
Complex.@t@cr, 百拇医药
Protein A affinity chromatography.@t@cr, 百拇医药
100%.@t@cr, 百拇医药
<5min.@t@cr, 百拇医药
A small-medium.@t@cr, 百拇医药
Simple
2.5 纯化抗体的初步应用 兔抗DH5α酶标抗体的应用：采用文献[3]的改良过碘酸钠氧化法，对上面纯化的兔抗DH5α抗体标记辣根过氧化物酶。4mgHRP与6mg兔抗DH5α结合，得2ml，共4.194mg的HRP-IgG。当包被兔抗DH52 IgG浓度为4μg/ml、DH52菌体蛋白浓度0.625ng/ml时，将此酶标抗体稀释4 000倍，测得A492nm为1.148。此结果进一步说明，用Protein-A Sepharose亲和层析柱纯化的抗体纯度高，并很好地保持了IgG的免疫活性，符合制备HRP标记抗体的标准。;&ctk1, 百拇医药
2.6 结论 Hitrap Protein-A Sepharose柱纯化抗体，纯度高、效率好。反复使用数十次，抗体纯度和活性不受影响。该层析系统对不同动物血清IgG有不同的吸附能力。这方面的数据应进一步积累，以便为抗体纯化工作提供选择依据。我们对该方法的实验条件进行了摸索，首先，各阶段洗脱体积都应适当加大，比如，按说明书上方法，要求使用5个柱床体积PB洗脱杂蛋白，但我们用此体积时，A280仍大于0.1，并未将杂蛋白完全洗净，所以我们使用的是8个柱床体积PB来洗脱杂蛋白。对上样量测试结果显示，1ml Hitrap Protein A Sepharose每次上样1ml较为适宜，超过2ml可造成IgG的损失。;&ctk1, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，37岁，硕士，助理研究员;&ctk1, 百拇医药
参考文献;&ctk1, 百拇医药
1 萨母布鲁J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指导.金冬雁，黎孟枫，等译.北京：科学出版社，1992;&ctk1, 百拇医药
2 方福德，周 吕，丁 濂，等.现代医学实验技巧全书(下册).北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995;&ctk1, 百拇医药
3 李成文.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992;&ctk1, 百拇医药
4 汪濂主.现代医学实验方法.北京：科学出版社，1997;&ctk1, 百拇医药
(1998-06-15收稿；1998-12-29修回)(邓瑞春 张明伟 白云秀 汪劲松 黄 英 毛 宁)